باکتری ویبریو: روش های جداسازی و تشخیص باکتری ویبریو در مواد غذایی

گونه ویبریو‌ باکتری‌هایی هستند میله‌ای، مستقیم یا خمیده که به خانواده‌ی ویبریوناسه متعلق بوده و گرم منفی و بی هوازی اختیاری می‌باشند که توسط یک تاژک قطبی (فلاژل‌های قطبی غلاف‌دار) به حرکت در می‌آیند.

اکسیداز و کاتالاز مثبت‌اند و قادرند که هم به کمک تخمیر هم تنفس، متابولیسم خود را انجام دهند. ویبریو‌ها مانند باکتری‌های خانواده آنتروباکتریاسه به مواد مغذی خاصی نیاز ندارند. این میکروب‌ها در محیط‌های دریا و آب‌های شیرین یافت می‌شوند و از عوامل شایع بیماری‌های روده‌ای و خارج روده‌ای محسوب می‌گردند.

نمک طعام موجب تسریع رشد تمام گونه‌ها می‌گردد و یک نیاز ضروری برای برخی از آن‌هاست. جنس ویبریو شامل چند گونه‌است که مهم‌ترین آنها ویبریو کلرا، ویبریو پاراهمولی تیکوس و ویبریو ولنیفیکوس هستند.

اپتیمم نمک جهت ویبریو پاراهمولی تیکوس 3% می‌باشد، اما در مقادیر بین 0.5 تا 0.8 قادر به رشد است. حداقل فعالیت آبی جهت رشد ویبریو پاراهمولی تیکوس بسته به نوع ترکیبات محلول جهت تنظیم فعالیت آبی بین 0.936 تا 0.986 متفاوت است.

اپتیمم دمای رشد ویبریو‌های انترو پاتوژن (پاتوژن روده‌ای) 37 درجه می‌باشد و رشد آنها در 5تا 43 درجه به اثبات رسیده است، هرچند که دمای حدود 10 درجه به عنوان حداقل دمای رشد معمول این ارگانیسم در محیط‌های طبیعی در نظر گرفته می‌شود.

ویبریو پاراهمولی تیکوس نسبت به ویبریو کلرا معمولا در برابر دماهای خیلی زیاد مقاومت کمتری دارد. تعداد این ارگانیسم در حرارت‌های پایین و زیر حداقل دمای رشد و در شرایط انجماد به آهستگی کاهش می‌یابد به طوریکه در دمای 18- درجه بعد از 8 روز میزان کاهش به اندازه دو سیکل لگاریتمی در تعداد آن مشاهده گردیده است.

ویبریو پاراهولی تیکوس به خوبی در PH کمی بالاتر از محدوده خنثی (5.7 تا 5.8) رشد می‌نماید و توانایی ویبریو‌ها جهت رشد در شرایط قلیایی تا PH=11 در فرآیند‌های جداسازی آنها مورد استفاده قرار می‌گیرد.

ویژگی‌های بیماری‌زایی

متداول ترین آزمون مورد استفاده برای بررسی خاصیت بیماری‌زایی ویبریو پاراهمولی تیکوس واکنش کاناگاوا می‌باشد که تمام نژادهای بیماری‌زای کاناگاوا مثبت (K+) و بیشتر نژاد‌های غیر بیماری‌زا کاناگاوا منفی (K-) هستند.

حدود 1 درصد ارگانیسم‌هایی که از دریا جدا می‌شوند و حدود 100 درصد ارگانیسم‌هایی که از بیماران مبتلا به التهاب روده‌ای معده‌ای جدا شده اند، K+ می‌باشند. نژاد‌های K+ یک همولیزین مستقیم پایدار در برابر گرما (TDH) و نژاد‌های K- یک همولیزین ناپایدار در برابر گرما و بعضی از نژاد‌ها هر دو را تولید می‌کنند.

ثابت شده است که نوعی همولیزین مرتبط با پایداری حرارتی (TRH)، حداقل در بعضی از نژاد‌های ویبریو پاراهمولی تیکوس عامل بیماری‌زایی مهمی می‌باشد. از 214 نژاد ایزوله شده‌ی بالینی مورد آزمایش در یک تحقیق، 52 درصد آنها تنها TDH و 24 درصد هم TDH و هم TRH تولید می‌کنند.

از 71 نژاد جدا شده از محیط نیز 7 درصد آنها واکنش‌های ضعیفی با کاوشگر TRH نشان دادند ولی هیچ کدام با کاوشگر TDH واکنش ندادند. معمولا کاناگاوا با استفاده از گلبول‌های قرمز خون انسان در محیط کشت واگاتسوما آگار انجام می‌شود.

علاوه بر گلبول‌های قرمز خون انسان، گلبول‌های قرمز خون سگ و موش صحرایی نیز لیز می‌شوند. گلبول‌های قرمز خرگوش و گوسفند واکنش ضعیفی می‌دهند و گلبول‌های قرمز خون اسب لیز نمی‌شود.

جهت تعیین واکنش K، مایه کشت به صورت سطحی کشت داده شده و به مدت 18 تا 24 ساعت در دمای 37 درجه گرمخانه گذاری می‌شود. سپس از لحاظ انجام بتا همولیز کنترل می‌گردد.

از 2720 ویبریو پاراهمولی تیکوس جدا شده از بیماران اسهالی، 96 درصد آنها K+ بودند، ولی تنها 1 درصد از 650 ارگانیسم جدا شده از ماهی K+ بودند. به طورکلی ارگانیسم‌هایی که از آب جدا می‌شوند، K- هستند.

وزن مولکولی TDH معادل 4200 دالتون است. این ماده یک پروتئین کاردیوتروفیک و سیتوتوکسیک است که برای موش‌ها کشنده می‌باشد و در آزمون انسداد ایلئوم خرگوش پاسخ مثبت می‌دهد. به عبارت دیگر LD50 موش از طریق تزریق درون صفاقی (IP) 5.1 ug و دوز انسداد ایلئوم خرگوش 200ug می‌باشد.

همولیزین تحت کنترل PH بوده و تنها هنگامی که PH بین 5.5و 6.5 باشد تولید می‌شود. می‌توان گفت که همولیزین K+ به سلول‌ها در جذب آهن کمک می‌کند. با توجه به اینکه عصاره‌های اریتروسیتی لیز شده، خاصیت بیماری‌زایی این ارگانیسم برای موش‌ها را تشدید می‌کند. گیرنده‌های غشایی TDH، گانگلوزیدهای GT1 و GDIa می‌باشند که اولی نسبت به دومی محکم‌تر به همولیزین متصل می‌شود.

یک محیط کشت سنتزی جهت تولید هر دو نوع همولیزین پایدار و ناپایدار در برابر گرما ساخته شده است و بدین منظور وجود سرین و اسید گلوتامیک در محیط کشت ضروری است. پایداری حرارتی TDH به گونه‌ای است که بعد از تولید می‌تواند در مواد غذایی باقی بماند. در محیط بافر تریس و PH معادل 7، D120°c و

D130°c برای سم نیمه خالص به ترتیب 34 و 13 دقیقه به دست آمده ولی در میگو D120°c و D130°c به ترتیب 9.21 و 4.10 دقیقه محاسبه شد. هنگامی که تعداد سلول‌ها در هر گرم به 106 عدد برسد، همولیزین قابل تشخیص است و پایداری حرارتی آن در PH 5.5 تا 5.6 در مقایسه با PH 7تا 8 می‌باشد.

ژن TDH از نوع کروموزمی است و در اشریشیاکلای کلون شده است. انتقال ژن tdh به یک نژاد K- موجب تولید همولیزین خارج سلولی توسط آن نژاد می‌شود. توالی نوکلئوتیدی ژن TDH تعیین شده و یک کاوشگر اختصاصی ژن TDH ساخته شده است که شامل جفت باز 406 می‌باشد. 141 نژاد ویبریو پاراهمولی تیکوس با استفاده از این کاوشگر آزمایش شدند.

تمام نژاد‌های K+ حاوی ژن بودند و 16 درصد نژادهای K- با کاوشگر واکنش مثبت نشان دادند. با استفاده از آزمایش ELISA مشخص شد که تمام نژاد‌های حاوی ژن ،TDH تولید کردند. از 129 ویبریو دیگری که با ژن کاوشگر آزمایش شدند تنها پاسخ ویبریو هالیسا مثبت بود. در یک بررسی علمی امکان انتقال پلاسمیدهای R از اشریشیاکلای به ویبریو پاراهمولی تیکوس مورد آزمایش قرار گرفت.

برخی از ایزوله‌های بالینی که فاقد TDH بودند، دارای همولیزین TRH مرتبط با TDH هستند که توسط ژن TRH رمزگذاری می‌شوند. بیشتر ایزوله‌های ویبریو پاراهمولی تیکوس جدا شده از آب‌های ساحلی ایالات متحده واجد هر دو ژن TDH و TRH همراه با اوره آز بودند.

حداقل 12 نوع آنتی ژن O و 59 آنتی ژن K شناسایی شده‌اند، اما هیچگونه همبستگی بین این آنتی ژن‌ها و نژادهای K+ و K- ایجاد نشده است و گروه بندی سرولوژیکی جهت کمک به همه‌گیر‌شناسی این ارگانیسم کمترین اهمیت را دارد. از آنجا که تمام نژاد‌های K+ به آزمایش انسداد ایلئوم خرگوش پاسخ مثبت نمی‌دهند و چون بعضی از این نژاد‌های K- با التهاب معده‌ای روده‌ای در ارتباط بوده و گاهی اوقات تنها نژاد‌های جداشده می‌باشند.

خصوصیات بیماری و مکانیسم بیماری‌زایی ویبریو کلرا

ویبریو کلرا سروتیپ عامل وبای کلاسیک آسیایی است که برای چندن قرن قربانی‌های زیادی گرفته است. سال1961 بیوتیپ جدیدی از ویبریو کلرا به نام ال تور (el tor) عامل وبای پاندمیک شناخته شد. وبا هنوز عمل عمده بیماری ‌گاستروآنریت در ممالک در حال توسعه است.

گزارش سال 1989 سازمان بهداشت جهانی بیانگر نزدیک 50 هزار مورد وبا در دنیا می‌باشد. در کشور‌های توسعه یافته نظیر آمریکا سروتیپ غیر O1 بیشتر از تیپ کلاسیک سروتیپ O1 باعث گاستروآنتریت می‌گردد. سروتیپ غیر O1 سویه‌هایی را شامل می‌شود که با آنتی سرم O1 آگلوتینه نمی‌شود.
وبای کلاسیک از طریق مصرف آب آشامیدنی آلوده یا غذای غیر پخته خصوصا ماهی از شخصی به شخص دیگر منتقل می‌شود. باکتری به ترشحات معده بسیار حساس است و حدود 109 ویبریو در غذا یا آب لازم است تا بیماری ایجاد نماید که در مقایسه با سایر گرم منفی‌ها بسیار بالاست. چنانچه توسط بیکربنات‌ها و یا سایر ترکیبات ضد اسید خنثی شود تعداد 106 ویبریو نیز در ایجاد بیماری خواهد بود.
دوره کمون بیماری 1 تا 3 روز بوده و به دنبال آن استفراغ و اسهال ظاهر می‌گردد.

در اسهال شدید مدفوع به صورت مایع شفاف همراه با توده سلول‌های مرده دیواره روده تظاهر پیدا می‌کند که شباهت زیای به آب برنج دارد و لذا به نام اسهال آب برنجی معروف است که در صورت عدم درمان از دست دادن شدید آب بدن، موجب کاهش حجم و فشار خون، افزایش ویسکوزیته‌ی خون، نارسایی کلیوی و کاهش جریان خون می‌گردد و در برخی موارد مرگ عارض می‌شود.

در موارد شیوع در صورت عدم درمان، نرخ مرگ و میر حدود 30 تا 50 % می‌باشد اما در صورت درمان به کمک تزریق یا مصرف خوراکی محلول‌های الکترولیت / گلوکز این میزان به کمتر از 1% کاهش می‌یابد. از دست دادن آب بدن در اثر این عفونت به علت تولید سمی به نام کلراتوکسین می‌باشد. این سم با اتصال باکتری به دیواره‌ی روده‌ی کوچک و تولید پرگنه در مخاط آن ایجاد می‌گردد. اسهال می‌تواند 1 تا 5 روز دوام داشته باشد و تشخیص آن از سایر بیماری‌های اسهال دار مشکل می‌باشد.

در حالی که ویبریو کلرای تیپ O1 عامل وبای کلاسیک در کشور‌های در حال توسعه است. سروتیپ غیر O1 عامل بیماری در کشور‌های پیشرفته می‌باشد که برعکس ویبریو کلرای O1 در اشخاص حساس می‌تواند از طریق زخم‌های جداره روده به سپتی سمی منجر شود.

سپتی‌سمی ممکن است همراه با تهوع باشد ولی معمولا با اسهال توام نمی‌باشد. تب، لرز و تهوع ممکن است بروز کند. این میکروب ممکن است به صورت اسپورادیک بیماری ایجاد نماید. بیماری امکان دارد در اثر مصرف صدف‌های خام ایجاد شود. انسان میزبان اصلی این میکروب است و منبع اصلی موارد جدید بیماری نیز خود انسان می‌باشد.

از نظر مکانیسم بیماریزایی ویبریو کلرا جزء میکروب‌های غیر مهاجم محسوب می‌شود، اگرچه سروتیپ غیر O1 تهاجم محدوی را از خود بروز می‌دهد. کنترل ژنتیکی ویرولانس (کلراتوکسین) در مورد این باکتری برعکس اشریشیاکولای که در پلاسمید صورت می‌گیرد به کروموزوم مربوط می‌شود. ژن مسئول چسبیدن نیز روی کروموزوم حمل می‌گردد.

تحرک در هر دو سروتیپ O1 و غیر O1 از فاکتور‌های ویرولانس محسوب گشته و در نفوذ به لایه موکوسی روده نقش دارد. علاوه بر کلراتوکسین، ویبریو کلرا توکسین‌های دیگر نیز تولید می‌کند ولی نقش آنها در ایجاد بیماری هنوز خوب مشخص نیست. حتی تولید آندوتوکسین نیز اخیرا به عنوان عامل احتمالی دیگر تشدید بیماریزایی باکتری گزارش شده است.

خصوصیات بیماری و مکانیسم بیماریزایی ویبریو پاراهمولی تیکوس

این میکروب بخشی از فلور طبیعی میکروبی آب‌های مصب رودخانه‌ها را تشکیل می‌دهد. در طول ماه‌های زمستان این میکروب در رسوبات جایگزین می‌شود ولی با گرم شدن آب فعال شده و سخت پوستان دریایی را مورد هجوم قرارداده و در بدن آن‌ها پاراهمولی تیکوس یک عامل اسهال بی‌نهایت مهم بوده و مسئول بروز 50 تا 70 درصد موارد عفونت‌های روده‌ای می‌باشد.

وقوع بیماری عموما به طور مستقیم یا غیر مستقیم به مواد غذایی دریایی مربوط است بدین معنی که از این طریق مصرف مواد غذایی دریایی خام یا مواد غذایی دریایی که پس از پخت آلوده شده‌اند بیماری اتفاق می‌افتد.

از نظر مکانیسم بیماریزایی نقش همولیزین مقاوم به حرارت اهمیت زیادی دارد. همچنین زمان دو برابر شدن باکتری خیلی کوتاه (9دقیقه) بوده و در عرض چند دقیقه تعداد کثیری از باکتری تولید می‌شود. برعکس ویبریو کلرا این باکتری آنتروتوکسین تولید نمی‌کند و دارای قدرت تهاجم می‌باشد. تولید توکسین مشابه شیگلا گزارش شده است و بعضی سویه‌ها توکسینی به نام تترو دوتوکسین تولید می‌کند.

ویبریو پاراهمولی تیکوس علاوه بر دخالت در ایجاد التهاب روده‌ای معده‌ای، عفونت‌های روده‌ای دیگری نیز در انسان به وجود می‌آورد.

خصوصیات بیماری و مکانیسم بیماریزایی ویبریو ولنفیکوس

ویبریو ولینفیکوس یک میکروارگانیسم تهاجمی است که عفونت خونی اولیه با ضریب کشندگی بالا ایجاد می‌نماید. این میکروب جزء فلور طبیعی آب‌های دریایی می‌باشد. بسیاری از موارد عفونت مربوط به این میکروب خارج روده‎ای بوده و همراه با بروز زخم است.

بیماری با عفونت‌های شدید زخم و سپتی‌سمی خطرناک شروع می‌شود. سپتی‌سمی مقدماتی بیماری بسیار شدیدی است که 50 درصد تلفات به همراه دارد. سپتی‌سمی علاوه براینکه به دنبال ایجاد زخم در آب دریا و سخت پوستان دریایی اتفاق می‌افتد ممکن است از طریق مصرف صدف‌های خام دریایی نیز ایجاد گردد.

سپتی‌سمی بیشتر در افراد با ضعف ایمنی و بیماری قبلی کبدی دیده شده است ولی در افراد طبیعی نیز مشاهده می‌شود. مرگ و میر محدود به عفونت زخمی 7 درصد بوده و بسیار کمتر از میزان مرگ و میر حاصل از سپتی‌سمی می‌باشد.

عفونت با آنتی بیوتیک‌هایی مثل آمپی‎سیلین، کلرآمفینیکل، تتراسایکیلین و آمینوگلیکوزید‌ها قابل درمان می‌باشد.
ازنظر بیماریزایی این باکتری به شدت مهاجم است و عامل ویرولانس آن در کروموزوم جا دارد.

چسبندگی، مقاومت به فاگوسیتوز و سرم خون انسان از عوامل دیگر ویرولانس می‌باشد. آهن عمده‌ترین محدود‌کننده‌ی بقا و رشد میکروب در بدن انسان است.

باکتری قادر به تولید سیدروفورهای قوی می‌باشد. حداقل دو نوع همولیزین ایجاد می‌کند که سم‌های مهلکی هستند و فعالیت شدید سیتوتوکسیک دارند. انواع  میکروب، آنتروتوکسین نیز تولید می‌کنند که عامل اسهال می‌باشد.

ارتباط ویبریو با مواد غذایی و روش کنترل

گسترش ویبریو کلرا و ویبریو پاراهمولی تیکوس در محیط بهتر از سایر پاتوژن‌های انسانی جنس ویبریو شناخته شده است. این مسئله عمدتا به خاطر وجود محیط  غنی کننده مناسب و محیط جداسازی اولیه برای سایر ویبریوها، همچنین یافته‌های اخیر درباره‌ی ارتباط آن‌ها با بیماری‌های انسانی می‌باشد.

وبای آسیایی هنوز برای کشور‌های آسیایی به صورت اندمیک مطرح است و تصور می‌رود که در سال 1973 در آمریکا دوباره گسترش پیدا کرده و این در حالی است که اولین بار وبا در سال 1911 گزارش شده است. بعد از آن موارد اسپورادیک بیماری در آمریکا گزارش شده است.

ویبریو پاراهمولیتیکوس به علت مشابهت فیزیولوژیکی آن با سایر ویبریو‌ها در محیط دریایی در سراسر جهان یافت می‌شود ولی در بعضی موارد نیز از آب‌های شیرین و یا ماهیان غیر دریایی جدا گردیده است و در چنین مواردی نمک آب بالا رفته و یا آب دریا آلوده بوده است.

این ویبریوها به دفعات و با تعداد بیشتر در طول ماه‌های گرم سال جدا گردیده‌اند. تمام ویبریو‌های بیماری‌زا به طور طبیعی در محیط‌های دریایی اتفاق می‌افتند لذا آلوده کننده‌های طبیعی غذا‌های دریایی هستند و پیشگیری این آلودگی‌ها را در چنین فرآورده‌هایی غیرممکن می‌سازد.

مهم‌ترین معیار‌های کنترل جهت پیشگیری عفونت‌های این باکتری رعایت نکات بهداشتی (که از تکثیر باکتری در مواد غذایی غیر پخته جلوگیری و نیز از آلودگی مواد غذایی دریایی پخته ممانعت کند) می باشد. ویبریو‌ها عمدتا در حرارت‌های زیر 10 درجه زنده می‌مانند، ولی تکثیر آنها کند و یا محدود می‌گردد.

برعکس رشد باکتری در مواد غذایی دریایی آلوده‌ای که در شرایط یخچال نگهداری نشده است بسیار سریع می‌باشد. زمان دوبرابر شدن باکتری در انواع مختلف مواد غذایی دریایی که در حرارت 30 تا 37 درجه نگهداری شده اند 12 تا 18 دقیقه گزارش شده است. تمام انواع ویبریو‌ها به خشک کردن حساس می‌باشند.

در حالی که می‌توانند در دامنه وسیعی از درصد نمک رشد کنند (0 تا 10 درصد نمک). از آنجا که محیط طبیعی ویبریو‌ها در محیط آب‌های ساحلی می‌باشد، وقوع اسپورادیک التهاب روده‌ای معده‌ای توسط این باکتری‌ها با مصرف صدف‌های دریایی شایع می‌باشد.

کنترل ویبریو‌ها

تعداد ویبریو‌ها در آب‌های ساحلی با افزایش درجه حرارت آب افزایش پیدا می‌کند و در نتیجه تعداد آن در صدف‌ها و سایر آبزیان افزایش پیدا می‌کند. لذا از مصرف مواد غذایی دریایی خام در این فصول باید اجتناب شود.

برای نگه داشتن آلودگی ویبریو در حد پایین، مواد غذایی دریایی بایستی در یخچال و یا داخل یخ بلافاصله پس از صید نگهداری شوند. تمام گونه‌های جنس ویبریو در اثر حرارت دادن سریعا کشته می‌شوند. لذا پخت کامل و اجتناب از آلودگی مجدد روش مطمئنی برای سالم‌سازی چنین فرآورده‌هایی می‌باشد.

بعضی افراد با بیماری دیابت و یا آن‌هایی که ایمنی‌شان کاهش پیدا کرده (مصرف داروهای کاهش دهنده ایمنی، افراد الکلیک و افراد با سیروز کبدی) بایستی از مصرف هر نوع غذای خام دریایی در هر موقع از سال اجتناب نماید.

روش‌های جداسازی و تشخیص باکتری در مواد غذایی

در طول هر نوع کار آزمایشگاهی با انواع بیماریزای ویبریو بایستی به دو عامل مهم توجه نمود:

اول اینکه باکتری بی‌نهایت به سرما حساس می‌باشد و ممکن است در اثر شوک، سرما و یا نگهداری در درجات حرارت پایین، میکروب غیر فعال شود.

دوم اینکه شکنندگی اوسموتیک بسیاری از گونه‌ها در صورت انتقال آنها به محیط‌های با قدرت یونی کم و اثر غلظت نمکی محیط در رشد واکنش‌های بیوشیمیایی آنها می‌تواند مشکل ساز باشد. لذا تمام افرادی که با ویبریو‌های بیماری‌زا کار می‌کنند باید این دو عامل مهم را کاملا مورد توجه قرار دهند.

روش‌های سنتی کشت و جداسازی

غنی‌سازی ابتدایی با استفاده از یک محیط نسبتا غیر انتخابی مانند آب پپتینه قلیایی به علاوه 3 درصد نمک (APWS) و با آبگوشت تریپتیکرزسوی به علاوه 3 درصد نمک (TSBS) صورت می گیرد. محیط (APWS) مخصوص غنی سازی ویبریو کلراست و گرمخانه‌گذاری 6 تا 8 ساعت در 37 درجه صورت می‌گیرد.

درمورد ویبریو پاراهمولی تیکوس محیط(GSTB) جهت غنی‌سازی اختصاصی در سطح وسیعی مورد استفاده می‌باشد که در طول شب و حرارت 37 درجه گرمخانه‌گذاری می‌شود. محیط (APWS) همچنین در غنی‌سازی اولیه ویبریو ولنیفیکوس نیز مورد استفاده قرار می‌گیرد.

به علت حساسیت این باکتری به شوک سرما، محیط غنی‌سازی محلول‌های رقیق کننده بهتر است  در ضمن آزمایشگاه گرم نگه داشته شوند. محیط  جامد انتخابی جهت جداسازی کلنی با استفاده از محیط TCBS در سطح وسیعی خصوصا در مورد ویبریو کلرا و ویبریو پاراهمولی تیکوس مورد استفاده قرار می‌گیرد. در مورد ویبریو ولنفیکوس محیط CPCA یک محیط جامد انتخابی اختصاصی می‌باشد.

تشخیص باکتری

قبل از پرداختن به آزمایش‌های بیوشیمیایی بایستی توجه داشت که ویبریو‌ها که تغییرات جزئی در ترکیب محیط‌ های غنی‌سازی و بیوشیمیایی حساس می‌باشد. و ممکن است نتایج منفی کاذب در اثر این تغییرات پیش آید.
دو روش سریع در تشخیص ویبریو کلرا مورد استفاده قرار می‌گیرد که مهم‌ترین مزیت آنها عدم نیاز به وسایل پیچیده آزمایشگاهی است.

در روش اول که string test نامیده می‌شود، مقدار زیادی از یک پرگنه را در یک قطره بزرگ محلول 5 درصد دزوکسی کلات سدیم در سرم فیزیولوژی (5.8 در هزار نمک) به صورت تعلیق تهیه نموده، این تعلیق در مورد ویبریو کلرا به صورت محلول موکوئیدی کشدار نخی شکل در می‌آید که با استفاده از حلقه کشت حالت کشدار نخی شکل به ارتفاع 2 تا 3 سانتی‌متر مشاهده می‌شود.

آزمایش دوم که جهت تشخیص سویه‌های اپیدمیک ویبریو کلرا از سویه‌های غیر اپیدمیک و از سویه‌های ویبریو کلرای سروتیپ غیر O1 صورت می‌گیرد و به نام Rapid visual test موسوم است، به شرح ذیل انجام می گیرد:

1) در یک لوله آزمایش با استفاده از محلول Triton X-100 سلول‌های میکروب متلاشی می‌گردند.

2) محلول حاوی nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, glucose-6- phosphate اندیکاتور قلیایی dichlorophenol indophenol به آن اضافه می‌شود که طی آن در مرحله اول واکنش اندیکاتور قلیایی از رنگ آبی به صورت بی‌رنگ در می‌آید. این واکنش در مدت 30 دقیقه در حرارت اتاق صورت می‌گیرد.

3) با انتقال لوله آزمایش به حرارت 50 درجه نگهداری آن در طول شب، در این حرارت در صورت مثبت بودن آزمایش، دوباره رنگ آبی اولیه برگشت پیدا می‌کند که مبین سویه اپیدمیک ویبریو کلرا تیپ O1 می‌باشد.

تایید سرولوژیکی تشخیص ویبریو

آزمایش به طور ساده از طریق آگلوتیناسیون روی لام با استفاده از آنتی سرم پلی وان O1 انجام می‌گیرد. به هر حال این تکنیک در آزمایش مستقیم پرگنه‌ها از محیط‌های عمومی جامد جداسازی (مانند TCBS) مناسب نمی‌باشد.
اخیرا آزمایش Co-agglutination با استفاده از سلول‌های حساس شده Cowan GroupI Staphylococcus aureus ابداع گردیده که آزمایش پرگنه‌های محیط‌های عمومی جداسازی را امکان پذیر می‌کند.

درمورد ویبریو ولنفیکوس که به علت مرگ ومیر زیاد در اثر  عفونت، تشخیص سریع آن بسیار مهم است از آنتی‌سرم‌های ضد فلاژلای اختصاصی باکتری جهت تشخیص سرولوژیکی استفاده می‌شود.

تشخیص حدت یا بیماری‌زایی میکروب

الف) ویبریو پاراهمولی تیکوس

آزمایش کاناگاوا هنوز به عنوان مهم‌ترین وسیله‌ی تشخیص ویبریو پاراهمولی تیکوس مورد استفاده قرار می‌گیرد و روش آزمایش به شرح ذیل است:

1) تهیه محیط واگاتسوما حاوی ترکیبات عصاره مخمر 5 گرم، نمک طعام 70 گرم، کریستال ویوله 0.001 گرم، تریپتیکز 10 گرم، مانیتول 5 گرم و آب مقطر یک لیتر می‌باشد که 10 میلی‌لیتر تعلیق 20 درصد گلبول‌های قرمز خون تازه انسان به 100 میلی لیتر از محیط پایه مذاب در 50 درصد حرارت اضافه می‌شود در ضمن PH محیط پایه روی 5.7 تنظیم می‌گردد.
2) در محیط واگاتسوما (در ظرف پتری) از کشت 18 ساعته‌ی باکتری در آبگوشت به صورت نقطه‌ای یا عمقی کشت نموده. ضمنا یک شاهد مثبت نیز تهیه می‌گردد.
3) نتایج پس از 18 تا 24 ساعت گرمخانه‌گذاری در 37 درجه خوانده می‌شود.
4) مشاهده‌ی هاله‌ی همولیز بتا بیانگر ویبریو پاراهمولی تیکوس بیماری‌زا می‌باشد. همولیز آلفا یا تغییر رنگ دیگر نباید مثبت تلقی شود.

ب) ویبریو ولنیفیکوس

در اغلب آزمایشگاه‌ها تشخیص حدت این میکروب صرفا از روی شکل کلنی آن انجام می‌گیرد، طوریکه از دو فرم پرگنه که معمولا توسط این باکتری تولید می‌شود فقط پرگنه‌های کدر حدت‌دار هستند در حالی که پرگنه‌های شفاف فاقد حدت می‌باشند.